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研域(上海)教您细胞是怎么转染的
点击次数:107 发布时间:2018-10-26

 转染 ,是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。跟着基因与蛋白功用研讨的深化,转染现在已成为试验室工作中常常触及的底子方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微打针和基因枪归于通过物理方法将基因导入细胞的典范;化学介导方法许多,如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
 志向细胞转染方法,应该具有转染功率高、细胞毒性小等长处。病毒介导的转染技术,是现在转染功率的方法,同时具有细胞毒性很低的优势。但是,病毒转染方法的预备程序杂乱,常常对细胞类型有很强的选择性,在一般试验室中很难广泛。其它物理和化学介导的转染方法,则各有其特色。
需求指出的一点,不管选用哪种转染技术,要取得*优的转染效果,或许都需求对转染条件进行优化。影响转染功率的要素许多,从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长情况,到转染方法的操作细节,都需求考虑。
一、细胞传代
1. 试验预备:200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌),酒精棉球,废液缸,试管架,微量移液器,记号笔,培养皿,离心管。
2. 弃掉培养皿中的培养基,用1ml的PBS溶液洗刷两次。
3. 用Tip头参与1ml Trypsin液,消化1分钟(37℃,5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁,查询到细胞完全从壁上脱落下来中止。
4. 参与1ml的含血清培养基中止反应。
5. 用Tip头屡次吹吸,使细胞完全分散开。
6. 将培养液装入离心管中,1000rpm离心5min。
7. 用培养液重悬细胞,细胞计数后选择0.8X106个细胞参与一个35mm培养皿。
8. 将适合体积完全培养液参与离心管中,混匀细胞后悄然参与培养皿中,使其均匀分布。
9. 将培养皿转入CO2培养箱中培养,第二天转染。
二、细胞转染
1. 转染试剂的预备
① 将400ul去核酸酶水参与管中,轰动10秒钟,溶解脂状物。
② 轰动后将试剂放在-20摄氏度保存,运用前还需轰动。
2. 选择适合的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积:DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中参与适合体积的无血清培养基。参与适合质量的MyoD或许EGFP的DNA,轰动后在参与适合体积的转染试剂,再次轰动。
3. 将混合液在室温放置10―15分钟。
4. 吸去培养板中的培养基,用PBS或许无血清培养基清洗一次。
5. 参与混合液,将细胞放回培养箱中培养一个小时。
6. 届时后,根据细胞品种决议是否移除混合液,之后参与完全培养基继续培养24-48小时。
三、第2次细胞传代
1. 在转染后24小时,查询试验效果并记载绿色荧光蛋白表达情况。
2. 再次进行细胞传代,按照免疫染色适合的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞从头转入培养皿中。
3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

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