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人基质金属蛋白酶7(MMP-7)ELISA试剂盒的操作步骤
点击次数:70      发布时间:2022-09-19

人基质金属蛋白酶7(MMP-7)ELISA试剂盒的操作步骤

背景[1-3]

人基质金属蛋白酶7(MMP-7)ELISA试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法,用于体外定量分析人血清、血浆、细胞裂解液、唾液、尿液或细胞培养上清中MMP-7的含量。


检测原理:预先包被的抗体和检测相抗体都是亲和纯化级的MMP-7多克隆抗体。检测抗体经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后,PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应;经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的MMP-7呈正相关。


人基质金属蛋白酶7(MMP-7)ELISA试剂盒

基质金属蛋白酶是依赖锌和钙的内肽酶,能够降解细胞外基质的所有成分。它们在许多生理过程中发挥重要作用,如胚胎发育、组织成型、复制、再生等。它们参与很多病理过程如关节炎、癌症、心血管疾病。新合成MMPs的量主要由复制水平控制。MMPs的活性主要由酶原的活化和其抑制蛋白质(TIMPs)所调节。MMP-7由正常和疾病组织的上皮细胞分泌。MMP-7可降解一系列基质如Ⅳ型胶原,明胶,弹性蛋白和层联蛋白。MMP-7还能激活UPA和前MMP-1,2,9。本试剂盒所用标准品为重组人MMP-7,包含250个氨基酸,分子量28KDa。所检测MMP-7包括酶原和活性酶。


操作步骤

1.标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照随货说明书中图表在小试管中进行稀释。

2.加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl,待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

3.温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

6.加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。

7.温育:操作同3。

8.洗涤:操作同5。

9.显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟.

10.终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

11.测定:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。


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