弹性蛋白酶发酵工艺条件优化研究

本研究以我实验室分离、筛选的弹性蛋白酶产生菌—Pseudomonas sp作为出发菌株，利用诱变因子的协同作用，对其进行了诱变育种，得到酶活力较高的菌株Pseudomonassp SWU-B；研究了该菌株产弹性蛋白酶的动态变化过程；比较了不同的营养源与生长条件对菌株产弹性蛋白酶的影响，优化、确定了菌株产弹性蛋白酶的发酵培养基；探讨了菌株发酵产弹性蛋白酶的影响因素；初步确定了菌株发酵产弹性蛋白酶的工艺参数，结果如下： 1．三种不同的诱变因子对Pseudomonas sp菌体细胞的致死作用表现出相似的趋势，在一定范围内都与诱变剂量呈线性正相关，存活曲线呈指数型的“肩型”。利用紫外线（UV）、氯化锂（LiCl）和甲基磺酸乙酯（EMS）复合诱变的协同效应，在UV（2537~*10~（-10）m，30cm处，辐照60s）、EMS浸泡45min后，涂布于含有0.3％LiCl的脱脂奶营养琼脂平板（NSM）上。在协同诱变条件下，多轮反复诱变Pseudomonas sp后，菌株的酶活力有所提高，筛选到了弹性蛋白酶活力单位提高了35.49％的菌株—Pseudomonas sp SWU-B。诱变因子的复合、协同诱变，可以减弱单一诱变剂反复诱变产生的诱变抗性和饱和性，是一种有效的选育优良菌株的方法。 2．复合碳源有利于假单胞菌SWU-B （Pseudomonas sp SWU-B）产弹性蛋白酶；碳氮比（C／N）低的营养源，发酵液的zui终pH=8.2±0.4，利于弹性蛋白酶的产生和活性的稳定。葡萄糖、蔗糖混合碳素为营养源时，菌株产弹性蛋白酶的能力优于单一的碳源，能够促进菌株产生弹性蛋白酶；干酪素是产弹性蛋白酶的*氮源。试验结果表明：菌株SWU-B在营养组分为（g／L）：葡萄糖，1％；蔗糖，3％；干酪素，3％；Na_2HPO_4，0.3％；MgSO_4.7H_2O，0.01％；pH=7.2的液体培养基中能够较大限度地产生弹性蛋白酶。 3．Pseudomonas sp SWU-Bzui适生长温度为37℃，16h进入生长稳定期，在此时菌株开始大量的产生、分泌弹性蛋白酶；在28℃、150rpm振荡、12h种子液、4％接种量时，利于菌体产弹性蛋白酶，24h时达到产酶高峰。 4．菌体细胞壁膜的渗透性对弹性蛋白酶的分泌有较大的影响，发酵液中Tween80为0.2％（v／w）时能有效地促进酶的产生分泌；青霉素通过破坏细胞壁中的肽聚糖，改变细胞膜、壁的结构，能增加菌体的通透性，促进弹性蛋白酶 中文摘要 的分泌，其具体机制需要进一步研究。 5．弹性蛋白酶的亲和底物能激活 Pseudomonas Sp SWU－B菌体产弹性蛋白酶 的机制，促进弹性蛋白酶的产生。弹性蛋白、大豆分离蛋白均能诱导酶的产 生。发酵培养基中添加 0．40％（w／w）的大豆分离蛋白，能较好的诱导菌体产弹 性蛋白酶。酪氨酸、精氨酸能促进酶的产生，0刀1％的酪氨酸效果较好。 6．补加碳源、氮源和分段变温培养利于菌体产生弹性蛋白酶，在 12h时补 加一倍的营养源、改变培养温度能有效的促进酶的产生。添加消泡剂，改善了 菌体的生长环境，有利于弹性蛋白酶的产生。以花生油为消泡剂时，0．3％的添 加量效果较佳。 7．在优化的发酵条件下，Pseudomonas Sp SWU习经 24h五批次发酵后，原 发酵液平均酶活力达到 28UhaL，zui高达到 32U／inL，发酵液经盐析《NH4） 劣O＊和透析，酶的比活力达到 100U／mg．蛋白质，其潜在的开发价值较大。