血清蛋白醋酸纤维原理及操作

血清蛋白醋酸纤维原理及操作

原理
胶体颗粒在一定条件下可以带有电荷，带有电荷的胶体颗粒又可以借静电吸引力在电场中泳行，带正电荷者泳向负极，带负电荷者泳向正极，此种现象称为电泳。
血清中各种蛋白质都有它*的等电点。各种蛋白质在各自的等电点时呈电中性状态，它的分子所带正电荷量与所带负电荷量相等。将蛋白质置于比其等电点较高的PH缓冲液中，它们将形成带负电荷质点，在电场中均向正极泳动。由于血清中各种蛋白质的等电点不同，带电荷量多少有差异，蛋白质的分子量大小也不同，所以在同一电场中泳动速度也不同。蛋白质分子小带电荷多，泳动速度快；分子大而带电荷少，泳动较慢。血清蛋白在PH8.6的巴比妥缓冲液中进行电泳，按其泳动速度可以分出以下的主要区带，从正起依次为白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白等区带。
操作
1． 醋纤膜剪成2×8㎝大小，用铅笔在一端标号；
2． 电泳液：巴比妥-巴比妥钠缓冲液（称取巴比妥2.21克，巴比妥钠12.36克，溶于1000ml水中）；
3． 醋纤膜浸于电泳液中20min左右，夹于洁净滤纸中，吸去多余的缓冲液；
4． 将醋纤膜毛面向上贴于电泳槽支架上拉直，用边缘整齐的玻片沾取少量无溶血血清，按压于醋纤膜标号一端约2㎝处，注意与膜的边缘保持一定距离，待血清渗入膜后，滤纸上吸去多余血清；
5． 反转醋纤膜，使光面朝上贴于电泳槽中纱布两端，使其自然充满缓冲液，稍待片刻；
6． 接通电源，注意正负极切勿接错，电压90～150V，电流0.4～0.6mA/㎝，通电45分钟（冬季时间稍长60min）；
7． 关闭电源，取出醋纤膜染色；
8． 染色：氨基黑10b染色液（称取氨基黑10B0.1克，溶于无水乙醇20ml中，加冰醋酸5ml溶解；另取磺基水杨酸2.5克，溶于74.5ml水中；将二者混合摇匀即可）染色8min；
9． 漂洗：漂洗液（甲醇45ml、冰醋酸5ml与水50ml混匀）中漂去多余的染料，直至背景无色为止；
10． 洗脱，将漂洗干净的醋纤膜吸干，剪下各染色的蛋白区带放入相应的试管中，同时剪下与白蛋白宽度相当的空白区带作空白对照，在白蛋白管内加0.4mol/L氢氧化钠6ml（吸光度值×2），其余各管中加入3ml，振摇数次，置于37℃水温箱中20min，使其染料浸出；
11． 比色：620nm处读取各管吸光度值，然后计算出各自的含量；
12． 计算：吸光度值相加得总和，然后计算各自的吸光度值所占总吸光度值的百分比即为各自蛋白质的百分含量；