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小知识:试剂盒实验为何总出现假阳性?

2018-05-10 [3431]

近期不少客户向研域(上海)化学试剂业务员诉苦免疫组化中总呈现假阳性,很是头疼。今日小编我特意给您们找来了以往总结的经历,希望能协助更多的科研朋友!
1. 消除病理性色素的影响:
  当所检动物因为出血等原因构成吞噬含铁血黄素细胞增多时,为防止其与 DAB 显色呈现的黄褐色发作混杂,优先选用AEC显色剂。安排固定时刻过长时,切片中简单发作福尔马林色素颗粒,影响成果调查,选材时应充分用流水冲刷,以消除影响。
  切片制作不当引起的非特异性上色 在严峻变性、坏死及炎性病灶处,在胶原纤维和结缔安排部位,在切片裱贴不平、折皱处以及安排边际部位常会呈现非特异性上色。其间有的是因安排荷电状况改动而吸附抗体;有的机理不明;有的可能与安排边际或皱折深部的槽形构型有关,处理的办法是在滴加一抗前,以二抗动物的正常血清( 5 %~10 %)关闭、饱满电荷吸附位点和改善选材与制片技能。
2. 清洗不充分而构成的非特异性上色:
  应严厉操作规程。缓冲液中含一定量的盐,其有利于减低布景上色,一般运用 0.05mlo/L PBS ,溶液内参加吐温 20 ,效果更佳。特别符号时,试剂公司一般都供给缓冲液的配方。别的,在清洗后至参加下一步试剂前,不能干片,干片的部位会呈现非特异上色。
  DBA显色发作的某些布景颜色 运用浓缩型 DAB 试剂盒时,请严格依照说明书标明的滴加次序操作,留意校正蒸镏水的 pH 值,以确保试验成果的正确性。粉剂 DBA 溶解时,常有一些不溶性颗粒,这些颗粒须经过滤除去。不然可能堆积于切片安排上,发作斑驳状上色。别的, DAB 保存不当发作氧化物亦可堆积于切片上,因而需将 DAB 保存于避光枯燥处,现用现配,临用前加 H2O2。
3. 消除内源酶的影响:
  在触及免疫过氧化酶的各种染色中,均用过氧化物酶来符号抗体,酶的效果是催化底物,使显色剂显色,正常安排中也含有一定量的过氧化物酶,其相同也能催化底物显色,而影响免疫组化染色的特异性,因而在参加符号酶前应设法将其灭活,以确保染色反响的特异性。
  一般状况下,去除内源酶的办法是先用 3%的过氧化氢溶液效果,但在含有丰富血细胞的标本中,因为血细胞中存在很多具有活性的过氧化物酶,能与过氧化氢发作激烈的反响,发作气泡而破坏安排结构和细胞形状。在 OCT 包埋的冰冻切片中,运用 3%的过氧化氢化溶液亦会发作相似现象。此刻可用 3%的过氧化氢甲醇溶液孵育 20 分钟的办法灭活内源性酶。
  灭活内源酶对正确判别含血细胞较多的标本,如骨髓、胎盘、脾等的染色成果十分重要。相同,正常细胞也含生物素,尤以肝、脾、肾安排含量为多。在使用亲和素试剂的染色中,内源性生物素易结合后继抗体,构成亲和素(或链亲合素) - 生物素复合物,导致假阳性发作。消除这种非特异性上色的办法,是在选用生物素办法染色前,对标本进行亲和素处理,使其结合位点饱满。
4. 消除非特异性布景上色:
  非特异性上色zui常见的状况是蛋白质(抗体)吸附到安排切片中高度荷电的胶原及结缔安排成分上,防止非特异性布景上色的办法之一是在滴加一抗前在标本上加一种无关的蛋白质溶液,关闭荷电点不给一抗留有吸附余地,以确保一抗不会吸附到胶原纤维及结缔安排成分上。zui常用的无关蛋白质溶液是所用二抗的同种动物非免疫血清。用发作二抗的同种动物血清,是为了防止二抗与预先参加的蛋白质结合引起假阳性染色。
  用来阻断非特异性结合的血清不能有任何溶血现象。红细胞破裂会使其间的过氧化酶与底物效果,发作非抗原特异性的阳性上色。多克隆抗体因其成分杂乱,更易构成布景染色。稀释液选用含 1%BAS pH7.4 的 PBS ,一起在洗液中参加 0.05%的吐温 20 ( Tween20 )有助于消除布景染色。